光动力疗法的抗菌作用研究进展

发布时间:2022-01-24 02:27:17


  作者:杨澍、刘天军、洪阁,天津市第四中心医院药物临床试验机构;中国医学科学院生物医学工程研究所分子设计与纳米技术实验室

  光动力疗法是利用光和光敏剂产生的光动力效应进行疾病诊断和治疗的一种技术。近年发现,对皮肤局部微生物感染疗效显著,称为光动力抗微生物化学疗法(photodvnamic antimicrobial chemothempy,PACT),针对的病原菌包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、牙龈卟啉单胞菌及多重耐药菌等。在光动力治疗中,光敏剂的选择对抗菌疗效至关重要。

  在众多光敏剂介导的光动力抗菌研究中,人工合成单一成分的光敏剂所占比例最高,根据结构类型可分为卟啉类光敏剂、酞菁类光敏剂、卟吩类光敏剂等。

  1.卟啉类光敏剂:Prasanth等发现,吡啶取代的卟啉衍生物(PYP)介导的光动力杀灭牙周炎细菌作用强于咪唑取代的卟啉衍生物(IMP)(药物浓度均为5μmol/L,孵育20min,波长635nm,照射20min,强度50mw/c m2);而在不照光的条件下,两种光敏剂均无杀菌作用。Hanakova等123发现,50μmol/L(4-甲基吡啶基)卟啉(TMPyP)介导的光动力作用可以使铜绿假单胞菌的存活率下降15%,100μmol/L四(对磺酸基苯基)锌卟啉介导的光动力作用可以使金黄色葡萄球菌的存活率下降到23%,而二者对大肠杆菌疗效甚微,其存活率90%以上(均为孵育2h,波长414nm,照射24h,剂量0.5J/cm2)。Maisch等发现,由10μmol/L TMPyP介导,在100ms强脉冲光源照射下的光动力疗法(孵育10s,波长420nm,照射10s,强度60mw/cm2)可以产生足够量的活性氧,在几秒钟内杀灭萎缩芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。caminos等发现,10nmol/L四(4一N,N,N一三甲基氨基苯基)卟啉介导的光动力疗法(孵育20min,波长412nm,照射3h,强度90mw/cm2)可使大肠杆菌的生长延迟,而四(4-磺基苯基)卟啉对大肠杆菌无明显作用。

  2.酞菁类光敏剂:Ke等“1报道,两种单取代锌酞菁介导的光动力作用(浓度5nmol/L,孵育1h,波长610nm,照射20min,强度40mW先m2)能够杀伤金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)、大肠杆菌和铜绿假单胞菌,尤其对于后两种细菌,疗效更为显著。

  3.卟吩类光敏剂:Costa等哺1发现,0.5“mol/L二氢卟吩类光敏剂介导的光动力疗法作用5。10min具有显著的抗革兰阳性金黄色葡萄球菌作用,而10斗mol/L二氢卟吩类照射30min,则表现出显著的抗绿脓杆菌活性(均为孵育1h,波长650nm,强度150mW/cm2)。

  4.其他光敏剂:Maisch等”将核黄素衍生物引入正电荷,以便更好地吸附在带有负电荷的细菌表面,其介导的光动力作用(浓度50斗mol,L,孵育10s,波长450nm,照射10~30s,强度50mw/cm2)能有效杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠杆菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌等多重耐药细菌,治疗过程对人角蛋白细胞基本无影响。spath等”1发现,吡啶取代的非那烯一1一酮衍生物介导的光动力疗法(浓度10¨mol/L,孵育10s,波长405nm,照射120或40s,强度1260mw/cm2)治疗牙科细菌感染过程中,能产生超过97%的单线态氧,表现出较高的对粪肠球菌、变形链球菌和伴放线凝聚杆菌的抗菌活性,当剂量为50J/cm2、光照时间不超过1min时,几乎可以完全杀灭所有细菌,可见吡啶取代基在光动力杀菌方面具有重要作用。Kashef等91报道,由亚甲蓝介导、660nm激光照射下的光动力疗法(孵育30min,照射20min)对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大肠杆菌的作用,不依赖于亚甲蓝的浓度(25~loomg几),而依赖于光照剂量,当光照剂量达到109.2J/cm2时,可以显著抑制90%以上的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大肠杆菌。umeda等。”1发现,由10mg/L亚甲蓝介导的光动力疗法(强度1100mw/cm2,波长650nm,孵育10min,照射10或20s)还可以完全杀灭牙龈卟啉单胞菌和伴放线杆菌。Keshishvan等““报道,由维生素B2介导、蓝光照射的光动力作用(浓度10g/L,孵育1h,波长450nm,照射12~24h,强度2mw,cm2)可体外灭活大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌,而由亚甲蓝介导、蓝光照射的光动力作用则对上述细菌无效。

  天然产物光敏剂来源于植物,具有生物相容性好、来源广泛、化学结构新颖等优势,因此,近年来成为光动力抗菌研究的热点之一。Mamone等“23发现,阿根廷植物假烟叶树花瓣提取物介导的光动力疗法(浓度0.05g/L,孵育1h,波长670nm,照射2h,剂量55J/cm2)具有杀灭表皮葡萄球菌的作用。与人造光源相比,阳光照射能够彻底杀灭表皮葡萄球菌,而人造光源不能。因此,以天然产物作为光敏剂、阳光作为光源,能够显著提高光动力抗菌疗法的有效性。Andreazza等。引发现,植物巴西莲子草的环已烷和乙醇提取物含有甾体、三萜以及类黄酮类物质,其介导的光动力疗法(浓度100g/L,孵育24或48h,波长685nm,照射5min,剂量28J/cm2)具有抑制金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和杜氏假丝酵母菌生长的作用,然而同样浓度的该提取物在不照光的情况下,对上述细菌无显著影响。天然产物光敏剂来源广泛,将来可能在光动力抗菌方面得到长足的发展。

  靶向光敏剂具有作用部位选择性高的优势,将光敏剂制成脂质体等靶向制剂介导光动力疗法具有杀菌作用。Yang等将抗微生物肽(wLBu2)连接在光敏剂替莫泊芬的脂质体上,发现该靶向光敏剂介导的光动力疗法(孵育90或180min,波长652nm,照射100s,强度1w/cm2)具有显著的杀灭铜绿假单胞菌作用,并能够完全杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。其中,光敏剂浓度和孵育时间是控制治疗所产生不良反应的两个重要参数,药物浓度1.25仙mol/L、孵育90min条件下的光动力疗法便能杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,进一步降低两个参数可以减少治疗产生的不良反应,而治疗效果不会下降。对于铜绿假单胞菌,这两个参数对治疗效果和不良反应影响不大。他们在随后的研究中发现,靶向制剂麦胚凝集素wGA脂质体介导的光动力疗法(药物浓度12.5μmol/I.、孵育90min,其他条件同上)同样能够杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌,药物浓度和孵育时间的改变同样对灭菌效果影响不大,这两个参数可以进一步减小。由于激光的穿透性有限,Nakonechny等061利用化学发光作为光源(1.6mw/cm2发光强度12.1mW/cm2),亚甲蓝脂质体制剂介导的光动力(孵育20min,发光时间0~5min)抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的作用显著。针对金黄色葡萄球菌,激光和化学发光激发的光动力疗法(光敏剂浓度10μmol/L)疗效相当,而对于大肠杆菌,激光光动力抗菌效果(光敏剂浓度25μmol/L),发光强度8mW/cm2,孵育20min,照射时间0~1h)优于化学发光光动力作用。可见,化学发光激发的靶向光动力作用能够解决传统激光光动力穿透力弱的问题,并有效杀灭病原菌。

  高分子光敏剂通常具有水溶性好和生物相容性好的优势,有研究将聚维酮和多聚乙酰亚胺等高分子引入光敏剂,制成高分子光敏剂,发挥光动力杀菌作用。winter等“71发现,连接水溶性姜黄素的聚维酮(PVP—c)克服了天然产物在生理pH水平下迅速分解的缺陷,由50岫。儿光敏剂介导的光动力疗法(孵育15或25min,波长435nm,照射60min,剂量33.8J/cm2)可以杀灭几乎所有金黄色葡萄球菌。因此,该方法可能在伤口消毒方面得到广泛应用。Huang等发现,多聚乙酰亚胺和二氢卟酚轭合物介导、pH为10.0时的光动力疗法(浓度100nmo儿,孵育30min,波长660nm,照射30min,强度100mw/cm2)具有杀灭大肠杆菌作用,pH为5.0时的光动力疗法对金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的杀灭作用最强。

  光动力与其他抗菌方法联用可以弥补各自的不足,达到协同杀菌的目的。Kranz等发现,维生素E类似物Trolox能提高近红外激光照射下吲哚花青绿(ICG)介导的光动力杀菌作用(孵育10min,波长808nm,照射10min,剂量100J/cm2),较高的IcG浓度和光照量可以通过产生高热达到杀菌作用。不加Trolox,250mg/LICG介导的光动力无杀菌作用,而在Trolox的存在下,仅用50mg/LIcG介导便具有抗菌作用。500mg/LIcG介导的光动力作用可以使温度峰值达到64.53℃,超过细菌耐受水平而发挥灭菌效果。Tsai等报道,血卟啉或亚甲蓝介导的光动力疗法(浓度0.1μmol/L,孵育30min,波长635nm,照射30min,强度60mw/cm2)具有显著杀灭金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、酿脓链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和鲍曼不动杆菌的作用,然后利用低浓度的脱乙酰壳聚糖可以将上述细菌完全杀灭。该研究提示,脱乙酰壳聚糖具有光动力杀菌增效作用,其作用强度与光动力对细菌的损伤程度和脱乙酰壳聚糖的脱乙酰水平有关。

  由于国内外多种类型光敏剂介导的光动力作用体外研究的大量开展,光动力抗菌在临床上的应用得到了长足的发展。黄素芳等n¨比较光动力治疗组(波长635nm,能量密度100J/cm2,照射时间20min,每日照射2次,照射14d)和黄柏液换药组治疗手指人咬伤后深部感染的疗效,发现光动力疗法杀灭难治陛厌氧菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌效果更佳。王熙军等92荆用20%氨基酮戊酸(ALA)介导的光动力疗法(光源为632.8nm激光,能量密度looJ/cm2,每周1次)和外用特比萘酚乳膏(每周2次)分别治疗老年糖尿病患者念珠菌生间擦疹,结果显示,光动力疗法在短时杀灭病原菌方面效果更好。

  光动力抗菌的作用机制复杂,目前尚不清楚,其基本原理合适波长的光激发光敏剂从低能量的基态跃迁至高能量的三线态,并与目标微生物的生物分子反应,产生自由电子和(或)自由基(I类光动力反应),或者是三线态光敏剂首先与三线态氧分子作用,生成单态氧,然后单态氧再对目标微生物产生毒性,达到灭活微生物的目的。除此之外,近年来国内外报道的相关研究主要有以下几方面。

  1.一氧化氮合酶和促炎性细胞因子表达变化:Jeon等将痤疮丙酸杆菌皮内注射到美国癌症研究所小鼠的左耳,测定由二氢卟吩e6介导、卤光灯照射下的光动力抗菌消炎作用,发现该方法可以抑制痤疮丙酸杆菌促炎性细胞因子和一氧化氮合酶的表达,但对环氧合酶2基本无影响。该方法有望替代抗生素应用于痤疮的治疗。

  2.细菌感染部位胶原分解放缓、上皮形成、羟脯氨酸内容物和胶原重塑增加:Sahu等研究聚一L.赖氨酸二氢卟酚(PL-cP6)介导的光动力疗法对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌感染的鼠伤口处胶原恢复的作用,结果显示,PL-CP6光动力治疗组较未治疗组在第5天显示出较低的基质金属蛋白酶(MMP)8和MMP9水平,更有序的胶原基质和更高的羟脯氨酸含量,而PL-cP6光动力治疗感染伤口较单独使用PL.cP6治疗,胶原分解的放缓超过2倍,表明光动力疗法加速鼠感染伤口愈合归因于胶原分解的放缓、上皮组织形成、羟脯氨酸内容物和胶原重塑增加。

  3.核酸结构改变:Alves等研究卟啉类光敏剂介导的光动力抗菌过程中大肠杆菌和瓦氏葡萄球菌细胞内核酸的变化情况。大肠杆菌和瓦氏葡萄球菌浓度均为5.0μmol/L,细胞数均为108个/ml,分别由5.0μmol/L此4-吡啶甲基卟啉(照射270min,强度4mw/cm2,孵育10min)和5.0μmol/L3一吡啶甲基卟啉(照射40min,强度4mw/cm2,孵育10min)介导的光动力作用均能杀灭大肠杆菌,核酸结构改变的程度为23srRNA16srRNA染色体DNA。瓦氏葡萄球菌经过0.5μmol/L3一吡啶甲基卟啉(强度4mw/cm2,孵育10min)介导的光动力作用5min后,核酸水平显著降低,而经过O.5umol/L4.吡啶甲基卟啉(强度4mw/cm2,孵育10min)介导的光动力作用5min后,核酸水平无明显变化。对于大肠杆菌,与其结合的3-吡啶甲基卟啉的数量比与其结合的4-吡啶甲基卟啉的数量多,而对于瓦氏葡萄球菌,与其结合的4-吡啶甲基卟啉的数量更多。该项研究表明,与致病菌结合的光敏剂的数量与光动力效率、核酸的减少无直接关系。

  4.对中性粒细胞聚集的影响:Tanaka等研究各种光敏剂介导的光动力抗菌治疗对鼠类外周血中性粒细胞水平的影响,结果发现,甲苯胺蓝和亚甲蓝介导的光动力作用后,超过80%中性粒细胞仍有活性,而使用赤藓红B、四氯四碘荧光素二钠、结晶紫、光卟啉、新亚甲蓝N、他拉泊芬钠介导的光动力作用后,有活性的中性粒细胞比例降低至70%以下。由此说明,甲苯胺蓝和亚甲蓝介导的光动力可以保证在最小程度影响中性粒细胞的情况下治疗特定部位的细菌感染。

  5.光动力作用产生的羟基自由基和单线态氧对细菌的影响:Huang等发现革兰阴性菌更容易受到羟基自由基的影响,而革兰阳性菌则对单线态氧更敏感。wang等通过对c60和c70富勒烯水溶性加成物介导的光动力疗法的抗菌作用研究发现,单线态氧可能更容易穿过革兰阳性菌的细胞壁,而渗透性较差的革兰阴性细菌的细胞壁需要更多的羟基自由基,从而引起细菌细胞损伤。

  PAcT作为一种治疗细菌感染的新方法,具有能够杀灭耐药菌株、抗菌谱广等优势。不同光敏剂介导的光动力作用对不同种类的细菌感染疗效不同,抗菌效果与光敏剂的选择、光敏剂的亚细胞定位、PAcT的剂量、细菌类型、细菌生长状态等多种因素相关。目前,对光动力治疗细菌感染尚有许多亟待解决的问题,如抗菌作用机制尚不清楚,针对特定细菌及多重耐药菌感染的最佳光动力治疗参数选择,PACT与其他治疗方式的最佳协同治疗方式的选择等,都值得进一步研究。